胡超 周菊英
【摘要】 研究表明，低温等离子体对肝癌、黑色素瘤、脑肿瘤、大肠癌、肺癌等具有一定的治疗作用。主要机制为：等离子体作用后使癌细胞内一氧化氮和活性氧水平增高，导致DNA损伤和线粒体功能障碍，细胞内线粒体凋亡通路被激活，改变了Bax/Bcl-2比例，活化凋亡蛋白caspase3、9，伴有细胞周期阻滞（G2-M期或S期），最终导致细胞生长阻滞和细胞凋亡；增加β-catenin磷酸化，导致β-catenin降解，抑制整合蛋白２、４以及细胞表面局部黏着斑激酶的表达，破坏细细胞黏附，降低细胞的迁移和侵袭活性。
[关键词]细胞凋亡；肿瘤治疗方案；等离子体；等离子医疗
Application of cold plasma in cancer therapy Hu chao, Zhou Juying. Department of Radiation of Radiation Oncology, First Affiliated Hospital of Soochow University, Shzhou 215006,China Corresponding author: Zhou Juying,E-mail:This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.
[Abstract] Research shows that cold plasma has therapeutic effect on hepatocellular, melanoma, brain tumors, colorectal cancer, lung cancer and so on. The main mechanisms are as follows :the plasma can increase the levels of nitric oxide and reactive oxygen species in tumor cells, lead to DNA damage and mitochondrial dysfunction ,activate mitochondrial apoptosis pathway, change the ratio Bax/Bcl-2,activate apoptosis proteins caspase3,9,accompainied by cell cycle arrest(G2-M phase or S phase),eventually induce cell growth arrest and apoptosis; increase β-catenin phosphorylation，lead to β-cation degradation, inhibit the expressions of integrin α4 and focal adhesion kinase on the cell surface ,destroy cancer cells adhesion and reduce cell migration and invasion activities.
[Key words] Apoptosis; Antineoplastic protocols; Plasma
所谓低温等离子体主要是为了区别于受控热核聚变产生的“高温”等离子体，后者的温度要达到10000eV以上，如此高温度的物质在通常条件下无法应用。在科学研究中用的低温等离子体通常其电子温度在几至几十电子伏特之间。在医学领域，低温等离子体作为一种新技术，已在等离子体灭菌、伤口愈合、皮肤净化、牙齿治疗等方面开展了相关的研究工作［14］，并取得了显著的成效。然而，有关等离子体杀伤肿瘤细胞的研究刚刚起步，用等离子体治疗肿瘤有可能成为传统治疗法以外的一种新的方法。已有 研究发现低温等离子体对脑肿瘤、大肠肿瘤、乳腺癌、 膀胱癌等都具有较强的抑制作用，而对正常细胞几乎无毒性。
1 低温等离子体的抗肿瘤作用
等离子体可以改变细胞的生长、繁殖特性。相关研究结果表明，适量的等离子体处理能够促进癌细胞凋亡，且不会对周围正常细胞产生明显的伤害。细胞坏死通常伴随产生胞内酶的快速释放和细胞破裂的产物，这些都会导致炎症的发生，不利于临床应用。而在细胞凋亡过程中，细胞膜保持完整，因此不会泄露导致细胞发生炎症的胞内物质，也就不会对周围的正常细胞组织造成伤害。
1.1 低温等离子体单独应用
Fridman等［5］使用等离子体对皮肤黑色素瘤细胞株ATCC A2085进行了处理，发现少剂量的等离子体能诱导癌细胞的凋亡，且不会杀死周围的正常细胞。Sensening等［6］用低温差压介质阻挡放电等离子体处理黑色素瘤细胞株（ATCC A2085、ATCC 30-2002、ATCC 30-2020），表明低温等离子体可诱导癌细胞凋亡，在等离子体处理后24h、48h、72h，随着时间的延长，癌细胞的凋亡率明显增加。以剂量为15J/cm2的等离子体处理癌细胞，48h后观察发现Caspase3裂解，TUNEL（用来检测细胞凋亡的试验）分析等离子体处理后的细胞凋亡增加，细胞内活性氧清除剂N-乙酰基-L半胱氨酸显著降低。Kim等［7］使用了基于空心纤维玻璃管的低温等离子体射流装置，可以靶向传递等离子体射流，尽管空心纤维玻璃管内径较小，等离子体射流流速较低，但仍可以诱导肺癌细胞（TC-１）和成纤维细胞凋亡，且TC-1肿瘤细胞比成纤维细胞更加敏感。这种装置可应用于内镜检查。
Keidar等［8］使用低温等离子体处理人支气管上皮细胞（HBE）、肺癌细胞株（SW900）时发现，等离子体对肺癌细胞具有杀伤作用，而对人支气管上皮细胞没有损害作用。Kaushik等［9］证实了低温等离子体对人恶性胶质瘤细胞株T98的毒性作用，可增加细胞死亡和细胞克隆形成的损失率，并可能对细胞的传代有一定的影响。克隆形成实验表明，等离子体不仅诱导T98细胞凋亡，也显著影响细胞的增殖能力，诱导了癌细胞的遗传基因损伤或变性。
Zhang等［10］使用等离子体针对人体肝癌细胞进 行研究，发现对肝癌细胞的致死效果与氧气／氩气混 合浓度有很大关系，且紫外线、O、OH和Ar原子能够 渗透到溶液底部直接作用于肝癌细胞。Kim等［11］采用常压等离子射流处理体外培养的人乳腺癌细胞株MCF-7，出现了明显的凋亡，同时也发现加氧氦等离子体气体被认为在诱导细胞凋亡中是很有效的。Walk等［12］研究氦常压低温等离子体（cold atmospheric plasma, CAP）对小鼠神经母细胞瘤的影响，用CAP消融直径为5mm的小鼠荷瘤，结果肿瘤生长减缓，并且小鼠存活率提高，中位生存期为15d和28d（P＜0.001）。Vandamme等［13］用介质阻挡放电低温等离子体治疗U87胶质瘤荷瘤小鼠发现，反复的长时间的等离子体处理荷瘤（20min，连续3d）可以对皮肤产生表浅的烧伤，造成皮下温度的增加和皮肤的pH值降低。经过连续５ｄ的等离子体作用，可观察到肿瘤体积明显减小。
1.2 低温等离子体和化疗联合应用
Georgescu等［14］用高压脉冲氦-氧等离子体射流处理人结肠株，由于COLO-320DM是一种多耐药细胞株，对化疗不敏感，维拉帕米是一种多药耐药逆转剂，研究者使用氦等离子体和维拉帕米联用处理COLO-320DM，发现COLO-320DM的凋亡率比单用等离子体处理时要高，提示等离子体可以和多药耐药逆转剂及化疗联合应用，以提高肿瘤治疗疗效。Kim等［15］研究发现，低温等离子体联合应用纳米金标记的抗FAK抗体作用于黑色素瘤细胞，可以导致黑色素瘤细胞死亡的效应比单独应用低温等离子体增大５倍以上，这种新的跨学科技术有作为一种补充常规疗法的巨大潜力。Köritzer等［16］在治疗胶质母细胞瘤时，使用了不同剂量的CAP，通过细胞增殖测定、免疫印迹法、细胞周期分析和克隆形成实验等证实无论是对替莫唑胺（temozolomide，TMZ）敏感还是耐药的细胞株，都具有抗肿瘤作用，更重要的是，CAP治疗能够恢复胶质瘤细胞对TMZ治疗的敏感性，二者合用可以抑制细胞生长和细胞周期阻滞，从而使患者在对TMZ耐药时发挥一定的疗效。
Brullé等［17］用胰腺癌细胞株MIA PaCa2-luc建立了小鼠胰腺癌荷瘤模型，用等离子体处理后，肿瘤体积明显减小，质量明显下降，和吉西他滨联用后，这种诱导作用更加明显。表明等离子体和抗肿瘤的药物组合使用，可能增加治疗肿瘤的效果。
2 低温等离子体抗肿瘤作用机制
低温等离子体中含有多种不同的活性成分，如紫外线（UV）、带电粒子（电子、正负离子等）、化学活性粒子活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮等，这些成分可能与肿瘤作用有关，例如短波灭菌紫外线（200-290nm)是造成伤害最大的紫外波段，其主要作用于生物体的蛋白质和DNA，使DNA的遗传特性发生变化，使蛋白质（酶、骨架蛋白等）变性，从而使生物体失活；等离子体中的带电粒子包括电子和各种正负离子，相关研究表明，这些带电粒子对病菌都有灭活作用；ROS对生物体作用时起着重要的作用。氧原子和含氧的活性粒子（O、OH、H2O2等）在杀菌过程中起到了主要的作用。当处理物或工作气体中含有水分子时，等离子体就会产生一定量的OH，OH具有较高的活性。当２个OH相结合时将产生H2O2，它能穿过细胞膜进入细胞内部，激活细胞周期关卡发出细胞瀑布式死亡信号。在等离子体的实际应用中，等离子体的能量密度与处理的目的有很大 的关系。低能量密度的等离子体（＜１J/cm2），能够有效地灭活细菌，但此时对正常细胞影响较小；中等 能量密度的等离子体（2~6J/cm2）能够导致细胞生长因子的释放，促进细胞增殖和细胞迁移，并能够促进 癌细胞的凋亡；高能量密度的等离子体（＞7J/cm2）则导致正常细胞的死亡；当等离子体的能量密度特别高 时（＞10J/cm2）会引起细胞坏死［18］。等离子体是通过它的活性成分对生物体进行综合作用，从而使得细胞骨架的微观结构或者蛋白质等大分子物质、遗传物质（DNA、RNA等）的结构或性质、微生物体内的细胞质体等发生变化，从而使微生物失活或者使其遗传性状发生改变，或者通过促使相关的酶活性发生改变，使活体组织的新陈代谢发生改变，从而达到抗肿瘤的目的。
2.1 ROS粒子介导的DNA损伤作用
Xu等［19］发现肝癌细胞HepG2经等离子体处理后，肝癌细胞增殖受到明显抑制，细胞膜没有受到明显的损伤，细胞发生皱缩，Annexin V/PI（一种标志细胞凋亡的方法）和Hoechst 33342（一种DNA燃料）染色后荧光阳性细胞明显增加，细胞内线粒体凋亡通路被激活，细胞内一氧化氮和ROS水平增高，caspase3、9的活性明显变强（caspase8活性没有明显变化），下调了Bcl-2水平，而上调了Bax水平，最终导致肿瘤细胞凋亡。在mRNA水平和蛋白质水平下调CDC2和cyclin B1，而上调p21和p53水平，表明等离子体通过降低细胞内的CDC2和cyclin B1的表达水平使细胞周期阻滞在G2-M期，同时这个过程也受到p21和p53的调控.Kim等［20］用等离子体诱导B16F10小鼠黑色素瘤肿瘤细胞凋亡，导致DNA损伤 和线粒体功能障碍，活化凋亡蛋白caspase3，处理过后细胞积累了标记DNA双链断裂的γ-H2A．X，同时 出现了p53肿瘤消除基因。Arndt等［21］用CAP处理黑色素瘤细胞株，结果表明CAP治疗诱导DNA损伤，促进亚G１ 期的产生，并明显增加细胞凋亡。此外，蛋白质阵列技术发现诱导促凋亡事件的发生，如p53和RAD17磷酸化，细胞色素c释放，caspase3激活。通过H3K9免疫荧光法、SA-β-gal染色和p21的表达，表明低剂量的CAP能诱导黑色素瘤细胞衰老。Volotskova等［22］研究发现，用低温等离子体处理乳头状瘤（308细胞株）、小鼠永生化细胞（PAM212）及正常细胞时发现，肿瘤细胞对低温等离子体治疗的敏感性取决于肿瘤细胞和正常细胞的细胞周期分布时相，在用低温等离子体处理细胞时，提示S期损伤的标志物 ΓH2A.X(pSer139)的表达会明显增高，而表达S期的细胞百分数的标志物5-乙炔基2`脱氧尿嘧啶核苷明显减少。Keidar等［8］研究发现等离子可有效抑制黑色素瘤细胞的黏附和生长，这可能与低温等离子体诱导肿瘤细胞凋亡相关基因和氧化应激通路改变有关。Vandamme等［23］等用低温等离子体在体外处理胶质母细胞瘤U87MG，结果表明低温等离子体产生大量ROS，导致DNA损伤，细胞周期阻滞，诱导了细胞凋亡。
2.2 等离子体中活性粒子破坏细胞之间的黏附作用
Kim等［24］使用射频大气压等离子体射流研究了等离子体对G361黑色素瘤细胞黏附分子的处理效果，结果表明，等离子体处理可以导致细胞从基底脱落，诱导黑色素瘤细胞的死亡、抑制整合蛋白α2、α4以及细胞表面局部黏着斑激酶的表达，并使肌动蛋白纤维成为扩散状。Lee等［25］用低温等离子体处理人类大肠癌细胞株HCT116发现，等离子体能诱导细胞生长抑制和细胞凋亡，并降低细胞的迁移和侵袭活性，增加β-catenin磷酸化，β-catenin的降解在等离子体抗癌细胞增殖活性中起了重要作用。
3 结语
低温等离子体具有良好的抗癌作用，且对正常细胞几乎无损伤作用，有可能成为治疗肿瘤的一种新模式。可以尝试将等离子体治疗肿瘤与化疗、放疗、手术或者靶向药物相结合，尤其是和放疗联用，或许可以提高射线对肿瘤的放射敏感性，从而提高疗效。虽然目前已经阐明了一些抗肿瘤的机制，但等离子体与生物体之间的相互作用机制以及各种活性成分是如何对生物体起作用的仍不很明确，这就要求人们进一步研究等离子体与生物体的作用机制，并研究适应于各种具体临床应用的等离子体装置、最佳工作条件等，从而使等离子体真正在临床医学中广泛应用。
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